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【文献速递】用于对付胞内细菌感染的细胞穿透肽工程化噬菌体
发布时间：
2026-03-31
本研究成功筛选出沙门氏菌噬菌体selz的GP94蛋白作为外源肽展示位点，建立了基于CRISPR-Cas9的非模式噬菌体工程化方法。通过展示细胞穿透肽HA-TAT，获得了胞内摄取效率显著提升的工程噬菌体selz HA-TAT，该噬菌体可通过内吞途径进入上皮细胞，高效杀灭胞内沙门氏菌，且对哺乳动物细胞无毒性。研究证实，Ig样结构域可作为非模式噬菌体表面展示的通用位点，CPPs融合是提升噬菌体内化效率的
【摘要】
由重庆医科大学儿童医院、中国科学院深圳先进技术研究院等团队在mSystems上发表了一篇名为【用于对付胞内细菌感染的细胞穿透肽工程化噬菌体】的文章。该研究针对沙门氏菌这一胞内致病菌引发的感染，以及抗生素耐药性加剧的临床困境，开发了基于非模式噬菌体的工程化改造策略。通过CRISPR-Cas9技术将细胞穿透肽展示于沙门氏菌噬菌体selz的Ig样结构域蛋白GP94表面，显著提升噬菌体内化效率，实现对胞内沙门氏菌的高效抑制。该研究建立了一套通用、简便的非模式噬菌体工程化方法，为胞内耐药菌感染的噬菌体疗法提供了可行、高效的新型技术路线。
【前言】
当前，沙门氏菌作为典型兼性胞内病原菌，可侵入多种宿主细胞并在胞内增殖，其胞内定位使其能逃避抗生素与宿主免疫攻击，加之耐药菌株的不断出现与传播，让沙门氏菌感染的临床治疗难度大幅增加，成为全球公共卫生领域的重大威胁。噬菌体疗法因宿主特异性强、对正常菌群干扰小、可在感染部位原位复制且毒性低，成为对抗耐药菌的潜力替代方案，但天然噬菌体的细胞摄取效率极低，难以有效作用于胞内病原菌，限制了其在胞内细菌感染治疗中的应用。细胞穿透肽（CPPs）虽能显著提升大分子的胞内递送效率，且已在模式噬菌体改造中展现出提升噬菌体内化效率的潜力，但因对非模式噬菌体结构认知有限，缺乏成熟的表面功能肽展示策略，导致非模式噬菌体的工程化改造进展缓慢。
同时，研究发现噬菌体表面的免疫球蛋白样（Ig-like）结构域常暴露于外侧，是潜在的多肽展示位点，却尚未被系统应用于沙门氏菌非模式噬菌体的改造。基于此，本研究旨在筛选并验证沙门氏菌噬菌体selz的Ig-like结构域蛋白GP94作为外源肽表面展示位点的可行性，建立基于CRISPR-Cas9的非模式噬菌体基因组编辑技术，实现CPPs在GP94上的高效展示，构建胞内摄取效率显著提升的工程化噬菌体并筛选最优CPP改造方案，验证其对胞内沙门氏菌的抑制效果与对哺乳动物细胞的生物安全性，最终建立一套通用、简便的非模式噬菌体工程化改造策略，为胞内及耐药细菌感染提供新型、高效的治疗手段。
【研究内容与结果】
（一）用于肽段展示的噬菌体蛋白候选物筛选与验证
通过生物信息学分析，从沙门氏菌噬菌体selz中鉴定出含Ig样结构域的GP94蛋白，经AlphaFold2预测其包含三个结构域，且与已知可用于噬菌体展示的RB49 Hoc蛋白、λ噬菌体gpV蛋白高度同源。利用CRISPR-Cas9技术将Avi标签与金结合肽（GBP）分别融合至GP94的N端，Western blot检测到生物素化的GP94蛋白信号，透射电镜观察到selzGBP噬菌体尾部结合10 nm金纳米颗粒，而野生型噬菌体无此现象，证实GP94可作为可靠的肽段展示位点。
图1 噬菌体蛋白候选物的筛选与验证用于多肽展示
（二）融合CPPs后工程噬菌体的生物学特性
选取7种高效胞内递送CPPs，通过CRISPR-Cas9技术与GP94融合构建工程噬菌体。双层琼脂实验显示，工程噬菌体与野生型selz均形成相似的半透明噬菌斑；一步生长曲线表明，两者潜伏期均为30 min，50 min达到平台期，裂解量为57-104个/感染菌，无统计学差异，证实CPPs融合不影响噬菌体的基本生物学特性。
表1 CPPs氨基酸序列信息
（三）CPPs提升噬菌体在哺乳动物细胞中的摄取效率
将野生型与工程噬菌体分别与HeLa、A549、Caco-2、THP-1、Raw264.7细胞共孵育，噬菌斑实验定量显示：在HeLa细胞中，selz HA-TAT与selz Transportan摄取量显著提升；在A549细胞中，selz HA-TAT、selz Transportan、selz Integrin、selz R7摄取量高于野生型；在Caco-2细胞中，仅selz HA-TAT摄取量显著升高，且其在所有受试上皮细胞中的摄取量均最高。共聚焦显微镜观察证实，selz HA-TAT孵育1 h后胞内出现荧光聚集，24 h内持续增加，且主要通过内吞-溶酶体途径转运。
图2 野生型与工程化 selz 噬菌体在不同细胞系中的细胞摄取
（四）工程噬菌体selz HA-TAT的表征与胞内杀菌效果
透射电镜显示，selz HA-TAT与野生型selz形态一致（宽度约86 nm、长度约95 nm，收缩尾长约113 nm），且在不同MOI条件下对沙门氏菌的体外裂解效果相近。胞内杀菌实验表明，selz HA-TAT处理后，HeLa细胞内细菌数量显著降低，杀菌效率达64%，A549细胞中杀菌效率为48%，而Caco-2细胞中无明显抑制效果；流式细胞术证实，HeLa细胞内沙门氏菌的mCherry荧光强度下降18%，直接证明胞内细菌被有效杀灭。
图3 野生型 selz 与 selz HA-TAT 的特征分析
图4 selz HA-TAT 对三种上皮细胞内沙门氏菌的杀灭效果
（五）体外抗菌效果评估
采用LDH法检测selz HA-TAT对HeLa、A549、Caco-2细胞的毒性，结果显示，与对照组及野生型噬菌体组相比，selz HA-TAT处理组的LDH释放量无显著差异，证实其对哺乳动物细胞无明显细胞毒性，具备良好的生物安全性。
图5 野生型与 selz HA-TAT 的细胞毒性
【结论】
本研究成功筛选出沙门氏菌噬菌体selz的GP94蛋白作为外源肽展示位点，建立了基于CRISPR-Cas9的非模式噬菌体工程化方法。通过展示细胞穿透肽HA-TAT，获得了胞内摄取效率显著提升的工程噬菌体selz HA-TAT，该噬菌体可通过内吞途径进入上皮细胞，高效杀灭胞内沙门氏菌，且对哺乳动物细胞无毒性。研究证实，Ig样结构域可作为非模式噬菌体表面展示的通用位点，CPPs融合是提升噬菌体内化效率的有效策略，为胞内耐药菌感染提供了新型治疗方案，有望应对全球抗生素耐药危机。
【启示】
本研究为噬菌体工程与胞内细菌感染治疗领域带来多重重要启示:
科研与技术角度：突破底层技术瓶颈
拓宽改造边界：证实非模式噬菌体具备巨大的工程化潜力。利用CRISPR-Cas9进行精准基因编辑，结合Ig-like结构域的通用展示策略，成功打破了以往仅能改造模式噬菌体的技术局限。
攻克靶向难题：将细胞穿透肽与噬菌体融合，有效解决了天然噬菌体内化率低、难以进入细胞的痛点，实现了对胞内病原菌的精准打击。
行业发展角度：开辟抗感染蓝海市场
填补胞内感染治疗空白：该思路可直接推广至结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌等顽固性胞内致病菌的治疗，为全球抗击超级细菌和耐药菌危机提供了极具潜力的新型替代疗法。
赋能大健康与动保产业：推动了工程化噬菌体疗法在人类医学与兽医学两大领域的交叉与实际应用，拓展了整个噬菌体行业的商业化想象空间。
本文译自：
Engineered phage with cell-penetrating peptides for intracellular bacterial infections
编译：董亚兵
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