【摘要】

【前言】

肠道细菌是肠道内最主要的微生物居民，在维持身体健康方面发挥着关键作用。肠道稳态的破坏与多种疾病的发生发展密切相关，可诱发炎症反应，并严重破坏肠道菌群平衡。传统抗生素疗法会清除致病菌和益生菌，从而进一步加剧肠道菌群失调并影响代谢转化。此外，耐药菌的快速出现和全球传播对公共卫生构成严重威胁。这些挑战凸显了创新治疗策略的迫切需求。

噬菌体作为具有高度宿主特异性的细菌病毒，具备精准靶向和调控微生物群中特定微生物的独特能力。除宿主特异性外，噬菌体还展现出快速增殖、资源丰富及易于物理化学修饰等优势特性。这些特性使其成为精准调控肠道微生物组的理想工具。目前噬菌体疗法已广泛应用于治疗多重耐药感染（包括肺部、泌尿道、骨骼及关节感染）和严重全身性疾病（如脓毒症）。尽管潜力显著，但针对胃肠道及肠道微生物群的噬菌体干预仍主要基于经验性治疗，且疗效存在个体差异。

近年来，为增强噬菌体口服给药的生物功能，研究者开发了多种递送载体，包括乳剂、脂质体、聚合物颗粒和水凝胶微球。其中，水凝胶微球因其高包封效率、强黏附能力、优异的生物相容性和良好的机械性能等显著优势而备受关注。尽管已有研究在体外成功利用水凝胶微球增强了包封噬菌体的酸稳定性，但基于微球载体的噬菌体治疗及肠道菌群编辑的转化研究仍较为有限，特别是在体内研究方面。

本研究为控制噬菌体剂量并延长肠道滞留时间，采用基于可食用材料的简单绿色制备方法实现噬菌体的封装与递送。

【研究内容与结果】

本研究选取了三种沙门氏菌噬菌体LPST83、LPST94和LPST153，这些噬菌体基于我们前期研究筛选，具有明确的遗传背景、广泛的裂解范围以及对沙门氏菌菌株的强效抗菌能力。通过抑制曲线评估噬菌体对模型沙门氏菌株的抗菌活性。抗菌实验结果表明，单独使用时，三种噬菌体均无法有效抑制细菌生长，无论感染复数（MOI）如何。相比之下，噬菌体组合显示出显著增强的抗菌活性。具体而言，LPST94与LPST153组合在高MOI条件下（MOI≥10）可完全抑制细菌生长24小时。

此外，与单一噬菌体相比，多种噬菌体联合使用在抑制病原体方面表现出更优的效能。这种增强效果可能源于各噬菌体靶向不同细菌受体，从而降低了噬菌体耐药性。后续实验选用LPST94与LPST153组合。为评估其效力，研究人员检测了STm对噬菌体的体外耐药性。结果显示，对LPST94耐药的STm仍对LPST153敏感。这些体外实验结果揭示了噬菌体应用的三个关键条件：选择有效噬菌体、实现高噬菌体滴度以及采用噬菌体组合。

通过电液动力喷涂法和钙离子交联法制备了HMs-Phages。将水凝胶前体聚合物（SA、HA和ES按1:1:1质量比混合）加入无菌去离子水中，总聚合物浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%和6%（w/v），随后在室温（25°C）下轻轻搅拌过夜。接着，将纯化的LPST94和LPST153按体积比1:1混合，总滴度为10⁹或10¹⁰ PFU /mL，随后按体积比1:9加入前体溶液中。

1.水凝胶物质的选择

孵育2小时后，纯SA-1微球中的包封噬菌体完全失活。相比之下，SA/HA-1微球保留约2×10³ PFU /g的活噬菌体，SA/ES-1微球保留4×10⁴ PFU /g。值得注意的是，SA/HA/ES-1微球表现出最高的噬菌体存活率，保留约1×10⁶ PFU /g，表明对噬菌体的保护效果最佳。高噬菌体存活率与靶部位点的抗菌效力直接相关。具体而言，SA/HA/ES-1微球中的包封噬菌体在SGF预处理后于模拟肠液（SIF）中表现出更优的抗菌性能。基于这些发现，SA/HA/ES被确定为后续实验的最佳配方。

图1 水凝胶物质的选择

2.HMs-Phages的制备与表征

采用电喷雾仪器制备了SA/HA/ES水凝胶微球。微球尺寸范围为133 ± 19至890 ± 25 μm（SA/HA/ES-1至SA/HA/ES-6）。高浓度聚合物溶液的高粘度增强了聚合物链缠结并导致形成更大的雾化微滴，最终产生更大尺寸的微球。并且随着溶液浓度的增加，表面变得更加致密。元素分布显示磷、硫、氮元素在微球中均匀分散，傅里叶变换红外光谱进一步确认了噬菌体负载，1545 cm-1处出现酰胺II峰，是噬菌体衣壳蛋白的特征性标记，证实噬菌体在微球中的成功包封。SA/HA/ES水凝胶微球均表现出约90%的高包封率。

3.HMs-Phages的保护与释放性能

在SGF（pH2.5）中孵育2小时后，SA/HA/ES-3、SA/HA/ES-4、SA/HA/ES-5和SA/HA/ES-6微球表现出更高的噬菌体存活率，高浓度聚合物增加形成的更致密的凝胶网络，减少了噬菌体暴露于酸性介质。大多数噬菌体在最初6小时内完成释放，且溶液浓度较低的微球配方表现出更快的释放速率。荧光图像显示，罗丹明B标记的噬菌体在模拟胃肠道环境中能有效从微球释放，证实了肠道靶向递送的成功。

4.HMs-Phages的生物安全性和肠道滞留评估

MTT 检测显示HMs-Phages对Caco-2和HT-29细胞均无显著毒性，所有测试浓度下细胞存活率均保持在90%以上，细胞染色结果表明，与对照组相比，任何微球浓度均未导致细胞存活率显著降低。

在7天给药期间中组织学分析显示，口服微球治疗与健康对照组相比，给药7天后受检组织未见明显炎症迹象。

未包被的噬菌体组在1小时于空肠、4小时于回肠呈现高荧光强度，8小时后荧光完全消失。HMs-Phages组在1小时和4小时时分别于胃和小肠显示出相似的荧光信号，8小时和12小时仍可检测到，直至24小时后消失。

1. HMs-Phages高效治疗沙门氏菌诱导的结肠炎

图2b、2c结果显示，单纯噬菌体治疗组未能缓解体重减轻或改善摄食量。相比之下，SA/HA/ES-1微球联合噬菌体治疗组在增加体重和摄食量方面表现出优异疗效，与环丙沙星给药组相当。图2d、2e显示Phages组粪便样本在第3天时硬度、形状和颜色较PBS组略有改善，但第5天后这些改善逐渐恶化，最终与PBS组持平，HMs-Phages和CIP干预均能有效缓解腹泻。图2f、2g显示HMs-Phages组与PBS组相比细菌计数约降低2000倍，保持较高的噬菌体滴度，微球载体提供的稳定肠道噬菌体递送。HMs-Phages组和CIP组均显示出对结肠长度恢复和脾肿大的抑制作用。

与PBS组相比，CIP组脾脏、肝脏和结肠中的STm负荷显著降低了3个对数单位。促炎细胞因子水平降至感染组的60%。

图2 HMs-Phages对小鼠STm诱导性结肠炎的治疗效果。

2.HMs-Phages精准编辑肠道微生物群

分类学分析显示各组微生物组成与丰度相似。 β 多样性分析进一步表明组间无显著差异，主坐标分析（PCoA）空间中未出现明显聚类现象，提示各实验组间基线肠道菌群结构具有相似性。STm感染及不同处理后，微生物群落出现显著改变。与健康组相比，STm感染组（PBS组）的操作分类单元（OTUs）、香农指数和辛普森指数均大幅下降，表明微生物丰富度和多样性显著降低（图3a–c）。值得注意的是，CIP组也表现出微生物多样性降低，这可能与其广谱抗菌作用有关。

与健康对照组相比，PBS组中粪杆菌属和瘤胃球菌属的丰度显著降低，而HMs-Phages治疗可使两者恢复至与健康对照组相似的水平。HMs-Phages治疗能精准裂解目标致病菌，同时促进有益微生物的恢复，从而将微生物群组成调控至健康状态。

图3 不同处理组小鼠肠道微生物组分析。

【结论】

1. 筛选出一种在体外表现出强效抗菌活性的噬菌体组合。随后证实，设计的SA/HA/ES水凝胶微球能有效保护胃内包裹的噬菌体，并促进其在肠道中的响应性释放。这种微球与噬菌体的组合，为调控小鼠肠道特定菌群提供了靶向且持续的干预手段。该策略成功将特定菌群限制在低水平并维持足够长时间，为肠道菌群重建平衡创造了关键时空窗口。

2. 与游离噬菌体治疗相比，通过微球靶向递送噬菌体能显著降低哺乳动物肠道中的沙门氏菌数量并减轻炎症反应。虽然抗生素表现出强大的病原体清除能力，但其非选择性杀菌作用会大量消耗有益共生菌（如粪杆菌属、瘤胃球菌属），导致明显的肠道菌群失调。靶向噬菌体递送策略规避了抗生素治疗常见的肠道菌群失调和腹泻问题，实现了对特定菌种的精准原位调控。

【启示】

本文译自：

In situ gut microbiota editing: enhancing therapeutic efficacy for bacterial colitis by compatible oral hydrogel microspheres with phages.

编译：常欣欣、李孟霖